全球最大电子杂志平台

用SARS冠状病毒全基因组芯片杂交方法分析SARS?裁oV

作者:吴小兵，任鲁风，马鑫，何新洲，袁振华，刘凤杰，赵革新，杨宇，张猛，董小岩，侯云德 分类：生物工程 上传者:ZCOM网友

[摘要]为从临床样品中检测和分析SARS-CoV病毒打基础，并为分析SARS-CoV病毒的复制和转录等机理提供一种有效方法。以SARS冠状病毒 TOR2株序列作为标准设计和制备一种覆盖SARS冠状病毒全基因组的寡聚核苷酸芯片，探针长度为70nt，每相邻的探针序列重复25nt，共660条。用该芯片分析了细胞培养的SARS-CoV病毒总RNA、7个SARS-CoV病毒的基因克隆片段。对RNA样品用随机引物进行反转录PCR获得cDNA。对DNA用随机引物扩增和dUTP-cy3标记。结果用这种芯片杂交检测SARS-CoV病毒RNA可见阳性信号呈全基因组分布，并且有多处连续的阳性信号点；用正常人的白细胞RNA为对照，杂交未出现明显阳性信号。检测7个SARS-CoV病毒基因克隆片段，在该片段相应的探针区段出现连续阳性信号点。这种方法可有效 地检测和分析样品中SARS冠状病毒全基因组的信息。图4表0参2
关键词：SARS冠状病毒（SARS-CoV）；全基因组；基因芯片；全基因组扩增
2002年11月在中国广东发现了第1例传染性非典型性肺炎病人，随后这种奇怪的疾病在世界范围迅速传播。世界卫生组织将这种传染病命名为严重急性呼吸道综合症（SARS）。目前认为这种传染病的病原是一种新的冠状病毒变种（SARS-CoV）。实验室检测方法主要包括RT-PCR检测、抗体检测和细胞培养。然而，由于冠状病毒是基因组最大的RNA病毒，其独特的复制机制决定了它易于发生基因变异。事实上，目前WHO认为，SARS的诊断主要依靠临床诊断和流行病学特征，上述实验室检测方法均存在一些问题。因此研制更准确的检测手段十分必要。为此，我们设计一种覆盖了SARS病毒基因组的全部序列的基因芯片，结合RT-PCR方法和芯片杂交技术在SARS病毒全基因组范围内进行检测，可望获得更全面的病毒相关信息。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 SARS病毒（BJ01株）RNA。由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。
1.1.2 7个SARS病毒基因片段：M蛋白基因（665bp，26383-27048），N蛋白基因（28105-29373），NS基因片段（1.3kb，15247-16545），S1基因片段（1.8kb，21555-23375），S2基因片段（1.7kb，23412-25124），用引物BNIoutS/BNoutAs扩增的PCR产物（190bp，18138-18327 ），用引物Cor-p-F3/Cor-p-R1扩增的PCR产物（348 bp，15255-15602）。上述片段是以SARS病毒（BJ01株）RNA为模板用RT-PCR方法扩增得到。各基因在基因组中的位置是以Genbank中公布的TOR2株的基因组序列顺序为标准。
1.1.3 末端氨基化的寡核苷酸探针 由北京赛百盛公司及北京三博远志公司合成。
1.1.4 反转录试剂盒 Promega公司产品。
1.1.5 PCR试剂 Taq酶为TAKARA公司产品，dNTP为上海生工公司产品。
1.1.6 Cy3标记的dUTP Amersham Pharmacia公司产品。
1.1.7 随机PCR引物 P01-1 GTT TCC CAG TCA CGA TCN NNN NNN NN， 北京奥科公司合成。
1.1.8 特异PCR引物 P01-2 GTT TCC CAG TCA CGA TC， 北京奥科公司合成。
1.1.9 醛基化的玻璃基片 购于美国CEL公司。
1.2 方法
1.2.1 芯片设计
以SARS冠状病毒 TOR2株序列（AY274119）作为标准设计探针。合成的探针长度为70nt，相邻的探针序列重复25nt，共计660条SARS冠状病毒探针。
1.2.2芯片制备和后处理
探针用3×SSC溶解，浓度为500ng/mL，每个探针横向重复3点，每点0.25mL，点直径130mm，点间距250mm，点均匀度标准方差10%。
探针排布：8个矩阵，每个矩阵14行18列，如图所示。探针按基因组5’至3’方向顺序排列，从矩阵1排列至矩阵8。在每一矩阵中采用自上而下、自左而右的排列方式。
点样后的芯片按基片生产厂商的说明书进行后处理和预杂交处理，干燥后室温保存备用。
1.2.3 RNA制备和反转录
用Trizol（GIBCO公司）按说明书制备样品总RNA。反转录反应体系为7ml样本RNA 1ml，6nt随机引物（250pmol/ml）2ml，2.5ml 10X反应缓冲液，2ml dNTP(10 mmol/L each), 4ml MgCl2（25 mmol/L each）,1ml AMV反转录酶（25U/ml）, 0.5ml RNA酶抑制剂（40U/ml），用DEPC处理的ddH2O 补足体积至25ml。 反转录反应条件：25℃10min，0.1℃/s升至42℃，保持1h，95℃5min，迅速冰浴。
1.2.4 PCR扩增和标记
以反转录产物或特异的SARS病毒 DNA片段为模板，先用3’端有9个随机核苷酸而5’端为特定序列的随机引物（P01-1: GTT TCC CAG TCA CGA TCN NNN NNN NN）进行5个循环的PCR扩增。反应体系为2μl反转录产物或DNA片段, 5μl 10´PCR 缓冲液，2.5μl 引物P01-1（100pmol/μl），1μl dNTP（10mmol/L），0.5μlTaq酶（5U/μl），用H2O补足至 50μl。95℃ 变性5min。反应条件为94℃ 1min，30℃ 5min，0.1℃/s 升温至 72℃，72℃ 3min，5 个循环。
取上述PCR产物用特定引物P01-2（GTT TCC CAG TCA CGA TC）进行PCR标记反应。荧光标记的底物为Cy3-dUTP。反应体系为5μl PCR产物，5μl 10´PCR 缓冲液，1μl引物P01-2（100pmol/μl），1μl dNTP（10mmol/L），1μl Cy3-dUTP（1mmol/L），0.5μlTaq酶（5U/μl），用H2O补足至 50μl。95℃ 变性5min。反应条件为94℃ 30s，40℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 1min，30个循环。
1.2.6 芯片杂交
用冰乙醇沉淀法沉淀上述PCR标记反应产物。将沉淀物溶于5μl ddH2O中，加5μl 2´杂交液混合，变性5min，冰浴。将标记物加于芯片的点阵边缘，小心加上盖玻片后放入杂交盒中。将杂交盒置于3´SSC液的湿盒中，65℃杂交2hr。用0.5´SSC，0.01% SDS室温洗片5min；再用0.06´SSC室温洗片5min。迅速500g离心5min甩干芯片。
1.2.7 扫描
将芯片放入扫描仪，用532nm波长激光（80％－100％发射功率laserpower，80％－100％增益调节PMT）预扫芯片，选择合适的发射功率与PMT值，将芯片矩阵位置设定为扫描区域，10nm精度扫描。
2 结果
2.1 SARS病毒（BJ01株）RNA检测
芯片扫描图显示，SARS病毒RNA检测在芯片上出现呈基因组分布的阳性信号点（图1A），大多数探针点出现阳性信号；3个重复探针点的信号强度基本一致；多处出现连续的信号点。而阴性对照（正常人白细胞RNA）的检测结果（图1B）则无明显阳性信号。
图1 SARS-CoV RNA及正常人白细胞RNA检测结果（图略）
2.2 特异性RT-PCR引物扩增产物的芯片检测
为了分析WHO推荐的检测SARS冠状病毒的特异性引物扩增的片段是否能与芯片上相应的探针杂交，我们选择了其中2对引物。其名称和序列如下：
BNIoutS/BNoutAs:
sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC
antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C
扩增片段长190 bp。
Cor-p-F2 (+) 5’CTAACATGCTTAGGATAATGG 3’,
Cor-p-F3 (+) 5’GCCTCTCTTGTTCTTGCTCGC 3’,
Cor-p-R1 (-) 5’CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3’,
扩增片段长348bp。
芯片检测扫描结果见图2。图2A为第5矩阵的探针排列，其中用颜色标示了上述2对引物扩增的PCR产物用荧光标记后与芯片杂交应出现的阳性信号所在的位置。可见在预期的探针位置上大多数都出现了连续的阳性信号。
然而，在其它探针位置上也有散在分布的阳性信号出现。该现象以CorpR1/F3引物扩增的产物更为明显，原因待查。
A 第5矩阵的探针排列
图2 2对SARS病毒特异性PCR引物扩增产物的芯片检测结果（略）
2.3 5个SARS病毒基因片段的芯片检测
用克隆于T-easy载体（Promega公司）上的M蛋白、N蛋白、S1蛋白、S2蛋白的完整ORF基因和一个NS蛋白的基因片段为模板经随机引物PCR扩增和荧光标记后与芯片杂交的结果见图3。可见在预计的探针位置上都连续出现阳性信号。此外，在预期的信号点外的其它位置也出现了散在的非预期的杂交信号，并且许多点信号值较强。这些信号点在重复实验中依旧分别在相同的位置出现。而用T-easy载体质粒DNA为无关模板的对照样品的杂交结果则未出现明显阳性信号点。
3讨论
2002年11月在我国广东省发现传染性非典型性肺炎，并迅速引起世界范围的爆发和流行。世界卫生组织将这种严重的传染病命名为严重急性呼吸道综合症（SARS）。从患者体内和分泌物中观察和分离到一种冠状病毒的新变种（SARS-CoV），被公认为是导致SARS流行和致病的元凶。快速、准确地检测SARS病毒对于预防、治疗和控制该疾病十分重要。目前检测SARS冠状病毒的主要方法包括RT-PCR方法、恢复期抗体检测法和细胞培养法。细胞培养法由于实验技术要求高、实验周期长、需要在P3实验室中进行等因素而难以成为常规的检测办法。RT-PCR方法虽然简单快速，但仅根据某一小段SARS病毒基因扩增产物判断阴阳性，对于S冠状病毒这样一个基因组大而且容易变异的RNA病毒容易出现判定失误。并且这种方法对SARS病毒基因组的变异也无法监测。 事实上，目前WHO认为，SARS的诊断主要依靠临床诊断和流行病学特征，上述实验室检测方法均存在一些问题。因此研制更准确的检测手段十分必要。因此本研究设计了一种SARS冠状病毒全基因组芯片，这种芯片覆盖了SARS病毒基因组的全部序列，结合RT-PCR方法和芯片杂交技术在SARS病毒全基因组范围内进行检测，可获得更全面的病毒相关信息，所报告的检测结果可列出所有阳性信号在SARS病毒基因组中的位置和对应基因名称。
在探针设计方面，参照了Wang D 和DeRisi JL等（1，2）考虑到检测的特异性和灵敏性，选择了长度70nt的寡核苷酸作为探针。相邻探针序列采用了25nt长度的重复，主要目的是消除探针序列之间的断点，提高检出率。这种设计策略参照了Wang D 和DeRisi JL等的病毒芯片设计原则，他们用病毒芯片的确定SARS病原是一种冠状病毒的研究中作出了重要贡献。经过初步的实验研究我们认为这种探针设计方案用于检测病毒核酸比更短的寡核苷酸探针（40nt）的灵敏度强。
样品RNA的反转录采用了6-mer随机引物。对反转录产物的扩增和标记采用了一种修改的PCR方法。其特点是不采用被检病毒基因特异的引物，而是用带某种特异末端序列的随机引物（1）将全部反转录产物扩增和标记。这种方法减少了一般的特异引物PCR方法造成检测污染的机会。
通过对SARS病毒RNA样品的检测，发现所有矩阵的多数探针都出现阳性信号。说明大多数探针是可以工作的。对7个SARS病毒基因片段的检测，在预期的探针点上出现了连续的阳性信号。说明检测结果能特异地反映被检核酸中SARS病毒基因及其在基因组中的位置。结果中我们还注意到，预期出现阳性信号的探针点中也有少数点的信号值非常弱。另外，检测SARS病毒样品和基因时，在非预期的探针点上也出现了散在的但明显的阳性信号。而对完全无关的RNA（如正常人白细胞RNA）或DNA样品（如T-easy载体质粒DNA）的检测则不出现阳性杂交信号。导致这种现象的原因尚不清楚。我们考虑有以下几个方面的因素需要排查：1）探针合成中编号出现的错误；2）芯片点样时拼板出现的错误；3）探针之间的污染。在排除了上述3个因素后，推测SARS病毒基因序列之间的交换和重排有导致出现较短的同源序列的可能。据此，我们认为出现在芯片上出现连续的阳性信号点对判定阳性结果具有重要意义。
目前，我们用该芯片检测了由301医院提供的200多例临床样品（痰、漱口水、全血、粪便）RNA。发现这种芯片对于临床样品中SARS病毒核酸的检测具有较好灵敏度，有关结果另文发表。本研究为SARS病毒的检测、复制和转录分析、大的缺失和变异分析及追溯SARS病毒的来源提供了一种新思路和方法。
致谢：感谢军事医学科学院微生物流行病研究所曹务春研究员提供SARS病毒（BJ01）RNA。